มหาวิทยาลัยมหิดล วิทยาเขตกาญจนบุรี อยู่ห่างจากอำเภอเมืองกาญจนบุรี ระยะทางประมาณ 50 กิโลเมตร จากอำเภอเมืองถึงวิทยาเขตกาญจนบุรี ใช้เวลาเดินทางโดยประมาณ 50 นาที หากเริ่มต้นเดินทางที่ศาลาว่าการจังหวัด กาญจนบุรี ให้ขับรถไปตามทางหลวงหมายเลข 323 (กาญจนบุรี-ทองผาภูมิ ) ถึงสี่แยกแก่งเสี้ยนให้เลี้ยวซ้ายไปทางอำเภอไทรโยคอีกประมาณ 45 กิโลเมตร วิทยาเขตกาญจนบุรี ตั้งอยู่ทางซ้ายของทางหลวง หมายเลข 323

นอกจากนี้ ยังสามารถเลือกใช้บริการทางด่วนพิเศษ M81 โดยมีระยะทาง 59 กิโลเมตร จากด่านท่าม่วง กาญจนบุรี ถึงแยกวงเวียนวังสารภี ให้ใช้เส้นทางบายพาส ถึงสี่แยกแก่งเสี้ยนให้ขับตรงมาทางหลวง หมายเลข 323 การเดินทางโดยรถยนต์ส่วนตัว ผู้ขับจะต้องตรวจสอบสภาพรถให้ดีก่อนการเดินทาง และควรขับรถด้วยความระมัดระวังเป็นพิเศษ เนื่องจากเส้นทางค่อนข้างลาดชัน